RP3: Hemostasia i Clonació

 

Hipotesis (Tradriga2+Ainhoa)

Hipòtesi 1: Un possible problema és que al passar el gen d'interès de la cèl·lula eucariota a la E.Coli, no s'ha realitzat un "splicing". 

Rebutgem aquesta hipòtesis perquè com s’ha mostrat anteriorment durant la prova de IPTG, la mostra de auditoria coincideix amb el control de antitrombina III.

Hipòtesi 2: Un problema podría ser el fet que no es va dur a terme la Retrotranscripció (de forma in-vitro), i per tant s'inocula ADN en comptes d'ARN en la cèl·lula hoste.

Rebutgem la hipótesis perquè anteriorment s’han realitzat uns cultius y s’ha comprobat com el creixement d’aquests plasmidis modificats és satisfactori.

Hipòtesi 3: La selecció de primers no és la idònia.

Aquesta hipótesis la rebutgem ja que en la prova d’electroforesi visualitzem que tant el primers escollits per la nostra seqüència i els primers estàndards coincideixen.

Hipòtesi 4: Una de les hipòtesis a tenir en compte és que el nostre gen d'interès pot no haver-se inserit adequadament.

Aquesta hipótesis la rebutgem ja que en els resultats del espectrofotòmetre visualitzem que tant en la corba de cinética de la nostra mostra com la de control, coincideixen en el mateix rang de absorbancia, cosa que si la absorbancia fos diferent implica que és una altra proteïna i que el gen no ha sigut inserit correctament,per tant el nostre gen d’interès ha sigut inserit adequadament

Hipòtesi 5:  La concentració de CaCl2 utilitzada per assimilació del plasmidi és insuficient.

Acceptem aquesta hipòtesi, ja que una falta de CaCl2 implicaria la no assimilació del plasmidi per part del nostre cep bacterià, la qual cosa provocaria al seu torn que a l'hora de realitzar la selecció de la nostra colònia diana, ens trobarien que no va haver-hi cap creixement bacterià.

Hipòtesi 6: El nostre gen d'interés conté dianes de restricció i per tan les ER el tallen.

Rebutgem aquesta hipótesis, ja que després de fer la selecció e identificació a través de 3 cultius ( 1r. Cultiu normal; 2n. Cultiu+ampicilina, 3r.Cultiu+ampicilina+un altre antibiotic) veurem que hi ha hagut creixement bacterià en la 3ra placa pel que les cèl·lules són transformades i amb el vector recombinant.

Informe final

Després de la formulació de nombroses hipòtesis i l'elaboració de les proves corresponents per a la seva validació, sempre seguint el procés de traçabilitat, el nostre laboratori ha arribat a la conclusió que l'error que provoca resultats anòmals en la quantificació de l'antitrombina III té origen en una deficiència tècnica en el coagulòmetre.

Per solucionar això i amb la finalitat d'assegurar uns resultats representatius de la realitat en els nostres experiments, procedirem a comprar un nou coagulòmetre o a reparar el que utilitzem i dur a terme un examen més exhaustiu del material i equipament del nostre laboratori per a evitar futurs errors.

 

Aquest repte ha estat un tema força interessant, en part pel tema de clonació, hem tingut l'oportunitat de comprovar un cas i poder treure les nostres pròpies idees o hipòtesis i amb això comprovar si són acceptables o si es rebutgen depès de la conclusió que traguéssim d'elles. Al fi vam aconseguir saber quin era el problema de tots i era el Coagulòmetre que no funcionava correctament i donava uns valors que no eren normals. Solucionem el problema, però gràcies a tot això ara sabem quina és la funció d'una auditoria i la feina que comporta tot allò.

Per finalitzar m'agradaria dir que jo Ainhoa Blanco he estat treballant amb un equip nou (Tradigra2), que a més érem a 6 persones, i me n'alegro que els allà pogut ajudar i ser-los de suport i ells per a mi, aquest repte amb ells ha estat complicat, però per sort hem sabut treballar tots units i hem aconseguit l'objectiu de tots, finalitzar el repte amb èxit. M'ha encantat treballar amb aquest equip i no descartaria poder treballar amb ells una altra vegada en un futur.